一、产品简介

欢迎使用由绿生恒生物科技有限公司研发生产的 2× Seamless Cloning Buffer。

本产品是一种高效、快速的单管"一步法"无缝克隆预混液。试剂中的2× Buffer 已预先混合了最优配比的特异性重组酶群与反应缓冲液，只需将线性化载体、目的片段与本产品混合，即可在 50°C 下 15~30 分钟内完成高效率的定向重组。本试剂盒不受载体酶切位点限制，可实现 1~5 个片段的无缝拼接，产物可直接用于转化，是常规克隆、高通量克隆及多片段组装的理想选择。

二、产品优势

• 极致简便：真正的 All-in-One 预混液，免去繁琐加酶步骤，减少移液误差。
• 超高阳性率：经特殊优化的酶群与缓冲体系，单片段克隆阳性率可达 95% 以上。
• 快速高效：单片段克隆仅需 50°C 孵育 15 分钟即可完成。
• 广泛适用：无论长短片段或多片段（最多5个），均能实现高效组装。

三、产品组分与保存

组分名称	50 rxns 规格	100 rxns 规格	保存条件
2× Seamless Cloning Buffer*	250 µL	500 µL	-20°C 避光保存
阳性对照载体 (50 ng/µL, 可选)	10 µL	10 µL	-20°C 保存
阳性对照片段 (20 ng/µL, 可选)	10 µL	10 µL	-20°C 保存
Nuclease-free ddH₂O	1 mL	1 mL × 2	-20°C / 4°C 保存

*注意：本品含高活性重组酶，请置于 -20°C 恒温保存，避免反复冻融（建议分装保存）。使用时置于冰上融化。

四、操作步骤

1. 载体与目的片段的制备

• 线性化载体：推荐使用双酶切或反向 PCR 扩增制备。强烈建议对线性化载体进行凝胶回收纯化，以降低空载假阳性率。
• 目的片段：引物设计时，需在 5' 端引入与线性化载体末端完全一致的 15~25 bp（推荐 20 bp）同源重组序列。
  （注：若以质粒为模板扩增片段，扩增后务必使用 DpnI 消化产物，或直接进行切胶回收以去除模板质粒。）

2. 重组反应体系配制（请在冰上操作）

组分	10 µL 体系	20 µL 体系	加样量推荐
线性化载体	X µL	X µL	50 ~ 100 ng
目的片段	Y µL	Y µL	见下方"摩尔比计算"
2× Seamless Cloning Buffer	5 µL	10 µL	1× (终浓度)
Nuclease-free ddH₂O	补足至 10 µL	补足至 20 µL	-

【DNA摩尔比计算指南】

• 单片段克隆：推荐最适载体与片段的摩尔比为 1:2。
• 多片段克隆：推荐最适载体与各片段的摩尔比为 1:1。
• 公式：片段所需质量(ng) = [载体质量(ng) × 片段长度(bp) / 载体长度(bp)] × 摩尔比

3. 重组反应与孵育

将配制好的体系用移液器轻轻吹打混匀（切勿涡旋震荡），短暂离心收集至管底。

置于 PCR 仪或恒温水浴中，50°C 孵育（单片段 15 分钟；多片段 30~60 分钟）。

反应结束后，立即置于冰上冷却 5 分钟。此时产物可直接转化，或 -20°C 短期保存。

4. 转化至感受态细胞

• 取 5 µL 重组产物，加入至 100 µL 融化于冰上的克隆感受态细胞（如 DH5α）中，冰浴 30 分钟。
• 42°C 热激 45~90 秒，迅速放回冰上静置 2 分钟。
• 加入 500 µL 无抗抗生素的 LB 液体培养基，37°C、200 rpm 振荡复苏 45~60 分钟。
• 离心收集菌体，涂布于含相应抗生素的琼脂平板上，37°C 倒置培养过夜。

五、常见问题分析 (FAQ)

Q1：平板上长出的菌落极少？

解决方案：确保感受态效率 ≥ 10⁷ cfu/µg；确保核酸 A260/280 在 1.8~2.0 之间；重新计算并调整加样量；检查引物，确保同源序列长度达到 15-25 bp。

Q2：假阳性率高（挑取的克隆大部分是空载体）？

解决方案：务必对线性化载体进行凝胶回收纯化；若片段以质粒为模板扩增，PCR 产物必须用DpnI酶切处理以去环状质粒污染。

六、实验安全与注意事项

• 本产品仅供科研使用（RUO），严禁用于临床医疗或诊断。
• 酶蛋白对温度敏感，实验操作时请全程置于冰上进行。